Extraction and purification of peroxidase from Thai black glutinous rice (Oryza sativa L. cv. Luem Pua)

Abstract

Plant peroxidases are classified as oxidoreductases which play important roles in several plant metabolic processes and are also useful in many applications. Peroxidase is involved in enzymatic browning and decrease in nutritional value that are the limiting factors for post-harvest change and shelf-life of various rice and cereals. Therefore, optimum conditions for extraction and purification of peroxidase from Thai Black Glutinous Rice (Oryza sativa L. cv. Luem Pua) which is a popularly consumed variety in Northern Thailand were investigated for future characterization. The rice seeds were germinated for 7 days, followed by crude enzyme extraction. The extract was further separated using two different processes including ammonium sulfate precipitation at 80% saturation and aqueous two-phase extraction. Toyopearl CM-650 cation exchange chromatography was selected for Luem Pua rice peroxidase purification. Peroxidase activity was assayed using guaiacol as a substrate, while protein content was determined using Bradford assay. Results showed specific activity of purified peroxidase obtained by ammonium sulfate precipitation and aqueous two-phase extraction of 12.97 and 0.65 unit/mg protein, respectively. Elution chromatographic profiles of two purification procedures showed similar pattern revealing two major cationic peroxidase isozymes.

เปอร์ออกซิเดสในพืช จัดอยู่ในกลุ่มออกซิโดรีดักเทส ซึ่งมีบทบาทสำคัญในกระบวนการเมแทบอลิซึมของพืช รวมถึง มีการนำมาประยุกต์อย่างหลากหลาย นอกจากนี้เปอร์ออกซิเดสยังมีส่วนเกี่ยวข้องในกระบวนการเกิดสีน้ำตาลที่เร่งปฏิกิริยา โดยเอนไซม์และการลดลงของคุณค่าทางโภชนาการ ซึ่งเป็นปัจจัยในการเปลี่ยนแปลงหลังการเก็บเกี่ยว อีกทั้งการเก็บรักษา ข้าวและธัญพืช ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงศึกษาการสกัดและกระบวนการที่เหมาะสมในการทำบริสุทธิ์เปอร์ออกซิเดสจาก ข้าวเหนียวดำไทยสายพันธุ์ลืมผัว ซึ่งเป็นข้าวที่กำลังได้รับความนิยมในการบริโภคในภาคเหนือของประเทศไทย เพื่อการศึกษา สมบัติต่อไป การทดลองเริ่มจากการงอกเมล็ดข้าวลืมผัวเป็นเวลา 7 วัน ตามด้วยการสกัดเมล็ดข้าวงอก แล้วนำสารสกัดหยาบ ที่ได้ไปทำบริสุทธิ์เบื้องต้นด้วย 2 กระบวนการ ได้แก่ การตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตที่ความอิ่มตัวร้อยละ 80 และ การแยกด้วยระบบน้ำสองวัฏภาค แล้วจึงทำบริสุทธิ์เอนไซม์ด้วยโครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออนบวก (Toyopearl CM-650) ทดสอบแอกทิวิตีของเปอร์ออกซิเดสโดยใช้ไกวอะคอลเป็นซับสเตรต และวิเคราะห์ปริมาณโปรตีนด้วยวิธี แบรดฟอร์ด ซึ่งพบว่าแอกทิวิตีจำเพาะของเปอร์ออกซิเดสหลังการทำบริสุทธิ์ด้วยกระบวนการที่ใช้การตกตะกอนด้วยเกลือและ การแยกด้วยระบบน้ำสองวัฏภาคมีค่าเท่ากับ 12.97 และ 0.65 ยูนิตต่อมิลลิกรัมโปรตีน ตามลำดับ ในขณะที่การทำบริสุทธิ์ ด้วยโครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออนบวกจากทั้ง 2 กระบวนการ แสดงถึงเปอร์ออกซิเดส 2 ไอโซไซม์หลัก ที่มีประจุสุทธิ เป็นบวกเช่นเดียวกัน